Nature报道:PTB精妙基因调控消除帕金森病症状

2020-06-27 编者:小麦 1109

2020年6月24日,加州大学圣地亚哥分校付向东团队在Nature 发表题为“Reversing a model of Parkinson’s disease with in situ converted nigral neurons”的研究论文,该研究发现在星形胶质细胞中敲降RNA结合蛋白PTB可将其直接转分化为功能性的神经元;这种仅需一步的转分化技术可在帕金森病小鼠模型中诱导产生新的多巴胺功能性神经元、重建受损的神经环路、恢复纹状体内多巴胺水平,并有效治疗帕金森综合征相关的运动障碍;更重要的是,使用抑制PTB的反义寡核苷酸(antisense oligo nucleotides, ASO)也能达到类似治疗效果。这项研究为帕金森病及其他神经退行性疾病提供了极具前景的治疗策略和方法,并获得了神经科学领域的广泛关注。该研究被选为Nature 的封面文章。


最后,瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所Ernest Arenas在Nature 在线发表题为"Method to combat Parkinson’s disease by astrocyte-to-neuron conversion"的点评文章,该文章系统点评了该研究成果,同时指出该研究有望为神经系统疾病(如帕金森氏病)的再生医学的发展开辟新的篇章。


神经退行性疾病是老龄化社会中人群健康的主要威胁之一。以帕金森病(Parkinson’s disease)为例,全世界已有超过一千万的患者,而目前所采取的药物和手术治疗只能延缓疾病恶化而不能彻底治愈。若要从根本上恢复患者的生理功能,则需体外移植或原位再生新的神经元。然而,利用诱导型多能干细胞(iPSC)分化的神经元进行移植治疗存在整合难、癌变性和免疫原性等问题。因此,从胶质细胞直接进行神经元原位转分化(trans-differentiation)将可能是根治神经退行性疾病的有效策略。不同于在胶质细胞中过表达神经元特异转录因子以诱导神经原位再生的“加法”策略[1-2],付向东教授提出了“减法”策略,即通过在非神经元细胞中敲降一个在神经分化过程中自然下调的关键抑制因子—RNA结合蛋白PTB—来诱导生成神经元,该方法更为简便、安全、易操作。

付向东教授是RNA功能基因组学领域的领军人物,而十年前一个偶然的发现将他引领到神经退行性疾病治疗方法研发。2009年,付教授的博士研究生薛愿超(现任中国科学院生物物理研究所研究员),在研究PTB在细胞内调控RNA剪切的位置效应和分子机制[3]时无意中发现,稳定敲降PTB的HeLa细胞长出了类似神经元的突起;深入研究发现,PTB敲降后的小鼠成纤维细胞可以转变成功能性的成熟神经元,该项工作于2013年在《细胞》(Cell )杂志上发表[4]。随后,薛愿超研究员与付实验室博士后钱浩博士通力合作,于2016年又在《自然-神经科学》(Nature Neuroscience )杂志上发表了人源成纤维细胞到神经元转分化的研究论文[5],阐明了人源细胞神经元转分化过程中需要以PTB和nPTB为主的两个调控环路。


在此基础上,钱浩博士等人在北京大学周专教授和西南医科大学康新江教授的鼎力协助下,经过不懈努力,终于实现将小鼠星形胶质细胞(astrocyte)敲降PTB、原位转分化为功能性神经元,并证实了“减法”策略对帕金森病模型小鼠有显著疗效。这一激动人心的工作于2017年12月第一次投稿到《科学》,其后又根据多方建议补充了大量实验数据,并于2018年11月投稿到《自然》,在今年5月被正式接收。从2017年9月至今,付向东教授一直秉持开放的科学态度,在国内外多个研究机构和学术大会分享了该项研究的实验设计和研究成果。特别是在2018年6月,付教授受邀中国科学院上海神经科学研究所介绍这项研究工作,引起了国内神经科学领域的高度关注,并获得广泛好评。


在这篇论文中,作者首先发现,分离的小鼠或人源星形胶质细胞在敲降PTB之后,可高效转分化为表达TUJ1和MAP2标志蛋白的成熟神经元,且这些神经元是有功能性的,具备神经特异的钠电流和动作电位,并可检测到突触后电流。


在得到体外实验证据后,作者构建了腺相关病毒载体,利用星形胶质细胞特异的启动子GFAP驱动PTB shRNA表达,并利用共表达的红色荧光蛋白进行示踪;将腺相关病毒注射到中脑(midbrain)后,发现在星形胶质细胞中实现了PTB的敲低,进而诱导神经元转分化;由于受脑区微环境的影响,在中脑转分化生成的神经元中有许多是表达TH的多巴胺能神经元。基于此,作者选择6-OHDA引发损伤的帕金森病小鼠模型,验证此策略原位再生多巴胺能神经元,发现新生的神经元可正常分泌多巴胺,并使小鼠受损的运动行为恢复正常。


为了确认由星形胶质细胞原位转化而来的新生神经元是否重建了受损神经通路,作者利用荧光微粒(retrobeads)逆向示踪技术,验证了新生神经元从中脑黑质(substantia nigra)到纹状体(striatum)的投射;并且又引入化学遗传学技术(DREADD)操控转分化神经元,观察到小鼠相应的运动行为取决于新生神经元的功能是否正常。这一系列实验结果,有力地证明了转分化诱导的神经元重建了受损的黑质-纹状体通路,逆转了神经损伤所带来的功能障碍。


除了利用腺相关病毒之外,作者还尝试给帕金森病小鼠注射抑制PTB的反义寡核苷酸,发现其同样能促进从星形胶质细胞到神经元的转分化,并且有效地逆转了小鼠运动缺陷的症状。这些发现不仅证实了反义寡核苷酸在诱导神经元转分化方面的有效性,还为开发帕金森病相关药物奠定了坚实的基础。


综上所述,付向东教授团队利用腺相关病毒shRNA或反义寡核苷酸药物降低PTB水平,成功地在帕金森病模型小鼠的中脑,将星形胶质细胞转分化为多巴胺能神经元,并有效地逆转了小鼠运动障碍的症状。无独有偶,今年4月中国科学院上海神经科学研究所杨辉组在《细胞》杂志上也发表了相关论文,他们以CRISPR-CasRx系统介导了Ptbp1敲低,分别在小鼠视网膜和大脑纹状体里将胶质细胞转变为视神经节细胞和多巴胺能神经元,进一步佐证了“减法”策略在治疗神经退行性疾病中的可行性[6]。


付向东教授实验室这项突破性研究工作历经十年,从生物学现象入手,首先详细解析了以PTB为核心的神经元分化调控机制[7],然后再从理论探索逐步推进到疾病治疗相关的临床转化上,展示了基础研究的无穷魅力和重要性。付向东教授表示:"当前的目标是尽快将这一技术推向临床试验,测试其对帕金森综合征患者的治疗效果。与此同时,我们也计划针对其他因神经元损失而导致的神经退行性疾病进行类似的研究,包括阿尔茨海默症,亨廷顿舞蹈病和中风等,我打算用余生全力以赴这些研发工作。”


参考文献

1. Pang, Z. P.et al.Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.Nature476, 220–223 (2011).

2. Guo, Z.et al.In vivo direct reprogramming ofreactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer'sdisease model.Cell Stem Cell14, 188-202 (2014).

3. Xue, Y.et al.Genome-wideanalysis of PTB-RNA interactions reveals a strategy used by the generalsplicing repressor to modulate exon inclusion or skipping.Mol Cell,36, 996-1006(2009).

4. Xue, Y.et al.Direct conversion of fibroblaststo neurons by reprogramming PTB-regulated microRNA circuits.Cell152, 82-96 (2013).

5. Xue, Y.et al.Sequential regulatory loops askey gatekeepers for neuronal reprogramming in human cells.Nat Neurosci19, 807-815(2016).

6. Zhou, H.et al.Glia-to-neuronconversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice.Cell181, 590-603 (2020).

7. Hu, J.et al.PTB/nPTB: masterregulators of neuronal fate in mammals.Biophys Rep4, 204-214 (2018).


专家点评


陈生弟(上海交通大学医学院附属瑞金医院教授、主任医师、博士生导师,现任上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科主任和神经病学教研室主任、中华医学会神经病学分会副主委、中国神经科学学会神经病学基础与临床主委,著名帕金森综合征专家)


帕金森病是常见的中老年神经退行性疾病,在我国65岁以上人群患病率为1.7%,且随年龄增长而升高。伴随着我国逐步进入老龄化社会,帕金森病已成为家庭和社会的沉重负担。帕金森病的病因是黑质多巴胺神经元进行性退变,进而导致纹状体区多巴胺递质减少、多巴胺与乙酰胆碱递质失衡。患者多表现出震颤、肌强直、动作迟缓、姿势平衡障碍等运动症状,以及不同程度的非运动症状,如嗅觉减退、睡眠障碍、便秘和抑郁等。目前,临床上采取药物治疗为主、手术治疗为辅的治疗手段。需要指出的是,无论是药物还是手术治疗,都只能改善患者的症状,而不能彻底阻止病情的发展,更无法治愈。彻底治愈帕金森病需要发展新型疗法(如原位再生多巴胺神经元)。


喜见Nature 期刊今日发表来自美国加州大学圣地亚哥分校付向东教授团队的研究工作,他们采用了极具创新性的原位转分化策略,通过敲降RNA结合蛋白PTB,即直接将中脑黑质区的胶质细胞转分化为功能性的多巴胺神经元,并显著改善帕金森病小鼠模型的运动症状。令人兴奋的是,付教授团队进而证明,采用反义寡聚核苷酸(ASO)也可在中脑原位产生多巴胺神经元,并有效改善6-羟基多巴胺诱导的帕金森病病理表型,为后续临床应用研究奠定了坚实的基础,也为治愈帕金森病带来了曙光!在该研究工作中,付教授团队综合运用了最严格的谱系追踪、化学遗传学、高效液相色谱、碳纤维电极等方法,严谨地证明了多巴胺神经元的再生及功能性。盼望此项研究成果快速转化到临床应用,为帕金森病患者造福!


庞志平(美国罗格斯大学罗伯特伍德强生医学院,神经及细胞生物学系副教授)


众所周知神经退行性疾病(包括帕金森氏病和早老性痴呆等)和神经损伤(包括脑中风,脊髓损伤等)不仅严重影响病人的生活质量,而且给家庭和社会带来沉重的经济负担。目前针对上述疾病治疗的一个根本问题就是如何解决神经元再生,而最近美国加州大学付向东教授在Nature发表的封面文章报道了原位转化中脑多巴胺神经元能够让帕金森氏病动物模型恢复运动功能,是神经元再生领域令人兴奋的研究成果!


近年来随着再生医学和发育生物学的发展,人们应用创新的手段在神经元的再生方面取得了一些令人兴奋的发现。譬如诱导性多功能干细胞的发现,利用四个转录因子让不同来源的细胞转化成为可能,发现者山中伸弥获得了2012年的诺贝尔生理或医学奖。技术上类似,用转录因子或microRNA让其他细胞转分化为神经元在2010-2011年也被斯坦福大学的Marius Wernig, Thomas Südhof以及GeraldCrabtree教授发现[1-3]。


其中,美国加州大学圣地亚哥分校付向东教授是学界公认的研究RNA和RNA结合蛋白方面的专家,在薛愿超研究员(现中科院生物物理所研究员)等的努力下在2013年发现RNA结合蛋白PTB调控的基因网络是限制细胞转分化为神经元的一个重要机制,先后在Cell (2013) 和 NatureNeuroscience (2016) 发文报道离体成纤维细胞向神经元的转化[4, 5]。这些早期的开创性研究为本文的发现奠定了坚实的基础。此前,暨南大学的陈功教授、中科院的陈乐平教授还有美国西南医学中心的张春立教授也在原位神经元再生方面取得过突破性进展[6-8]。


在此文中,付教授沿用他们前期的PTB基因网络的发现,报道敲降 PTB蛋白可以将小鼠和人的大脑胶质细胞转化为有功能的神经元,尤其是在体内可以将中脑脑黑质区的胶质细胞转变为多巴胺神经元。因为多巴胺神经细胞的死亡是帕金森氏病的元凶,这一结果让人尤其振奋。付教授课题组又发现在不同的脑区敲降PTB会产生不同类型的神经元,这也对再生医学非常有意义。接下来他们又发现中脑原位转化的多巴胺神经元的轴突不但可以长到前脑纹状体并且可以恢复帕金森氏病小鼠的运动行为功能。之前的一些策略(譬如Lorenz Studer等的研究)大都是在纹状体里移植早期胚胎多巴胺神经元以及干细胞分化的多巴胺神经元[9, 10],但是正常的神经网络能不能形成,能不能接受神经传入的调控却不得而知。


众所周知不同脑区的神经元接受的网络调控信息是不同的,所以付教授团队采取的原位再生策略可以获得区域特异性神经元,并受到正常的调控。接下来付教授他们又同北京大学的周专教授合作用碳纤维直接测量了多巴胺在纹状体的释放(周教授是发明碳纤维测量多巴胺的先驱),提供了令人信服的中脑原位转化的多巴胺神经元在轴突终末释放多巴胺的证据。最后他们又用化学遗传学研究了这些细胞的药物可控性,还筛选了高效转分化神经元的反义寡聚核苷酸。这些进展都为临床转化提供了坚实基础,使得这项研究成为再生医学领域的一个里程碑!


参考文献


[1]T. Vierbuchen, A. Ostermeier, Z.P. Pang, Y. Kokubu, T.C. Sudhof, M. Wernig,Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors,Nature , 463 (2010) 1035-1041.

[2] A.S. Yoo, A.X. Sun, L. Li, A.Shcheglovitov, T. Portmann, Y. Li, C. Lee-Messer, R.E. Dolmetsch, R.W. Tsien,G.R. Crabtree, MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons,Nature, 476 (2011) 228-231.

[3] Z.P. Pang, N. Yang, T.Vierbuchen, A. Ostermeier, D.R. Fuentes, T.Q. Yang, A. Citri, V. Sebastiano, S.Marro, T.C. Sudhof, M. Wernig, Induction of human neuronal cells by definedtranscription factors,Nature, 476 (2011) 220-223.

[4] Y. Xue, K. Ouyang, J. Huang,Y. Zhou, H. Ouyang, H. Li, G. Wang, Q. Wu, C. Wei, Y. Bi, L. Jiang, Z. Cai, H.Sun, K. Zhang, Y. Zhang, J. Chen, X.D. Fu, Direct conversion of fibroblasts toneurons by reprogramming PTB-regulated microRNA circuits,Cell,152 (2013)82-96.

[5] Y. Xue, H. Qian, J. Hu, B.Zhou, Y. Zhou, X. Hu, A. Karakhanyan, Z. Pang, X.D. Fu, Sequential regulatoryloops as key gatekeepers for neuronal reprogramming in human cells,Nature neuroscience, 19 (2016) 807-815.

[6] Z. Guo, L. Zhang, Z. Wu, Y.Chen, F. Wang, G. Chen, In vivo direct reprogramming of reactive glial cellsinto functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model,Cell stem cell, 14 (2014) 188-202.

[7] Y. Liu, Q. Miao, J. Yuan, S.Han, P. Zhang, S. Li, Z. Rao, W. Zhao, Q. Ye, J. Geng, X. Zhang, L. Cheng,Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo, TheJournal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience,35 (2015) 9336-9355.

[8] W. Niu, T. Zang, Y. Zou, S.Fang, D.K. Smith, R. Bachoo, C.L. Zhang, In vivo reprogramming of astrocytes toneuroblasts in the adult brain,Nature cell biology, 15 (2013) 1164-1175.

[9] S. Kriks, J.W. Shim, J. Piao,Y.M. Ganat, D.R. Wakeman, Z. Xie, L. Carrillo-Reid, G. Auyeung, C. Antonacci,A. Buch, L. Yang, M.F. Beal, D.J. Surmeier, J.H. Kordower, V. Tabar, L. Studer,Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animalmodels of Parkinson's disease,Nature, 480 (2011) 547-551.

[10]L. Studer, V. Tabar, R.D. McKay, Transplantation of expanded mesencephalicprecursors leads to recovery in parkinsonian rats,Nature neuroscience, 1(1998) 290-295.


来源:iNature

撰文|胡婧(电子科技大学医学院),钱浩(加州大学圣地亚哥分校)